蛋白质组学网-仪器介绍

    电喷雾（electrospray ionization ,ESI）是当今有机质谱中最软的电离技术，它是将样品溶液通过毛细管或喷雾针导入大气压电离源内，在汽化气的帮助下和源内毛细管终端和反电极之间的强电场作用下，样品溶液形成带电荷的雾，即电喷雾。当雾滴在大气压下蒸发时，随着溶剂的蒸发，由于液滴直径变小，液滴表面电荷密度增加，当液滴表面电荷达到雷利极限（Raleigh limit），液滴进一步裂变，再次达到雷利极限，再一次“爆炸”，如此循环，当溶剂从小液滴中完全蒸发后形成离子。生成的样品气相离子经质量分析器分析，测出它们的质/荷比。附图为电喷雾电离示意图。

     电喷雾四极杆飞行时间串联质谱仪Q-TOF2是英国Micromass公司（现为Waters公司）生产的新型串联质谱仪Q-TOF系列的第二代，离子源为电喷雾源，一级质谱是四极杆，主要起选择离子的作用，二级质谱为飞行时间质谱，是该仪器的主要质量分析器。Q-TOF2离子源为Z-spray的专利设计，有效防止离子源和仪器污染，防止热裂解，广泛适合HPLC各种分离条件并提高灵敏度，源隔断阀可有效保护真空系统和检测器，易于清洗离子源而无需放空仪器。配备有纳升喷雾源和毛细管液相色谱，可以进行离线的手动测序和自动化数据依赖分析（Data dependent analysis, DDA），大大提高了仪器的灵敏度和分析能力。纳升电喷雾串联质谱（nanoESI-MS/MS）是指离子源喷雾速度为20-40nl/min和喷雾形成的雾滴直径在纳米水平的电喷雾质谱，已经发展成为鉴定分析微量蛋白质的重要工具。2-3ml样品能够连续喷雾2小时，手动最多可测定10个肽段的序列。对蛋白质的鉴定率可达90%。

3.1 高灵敏度、高分辨率、高质量准确度 Q-TOF2是高性能的串联质谱仪，具有高灵敏（20fmole），高分辨率（FWHM，>10000）和高质量准确度（内标校正<5ppm）的优点，因此蛋白质等大分子的分子量测量误差在0.01%，一般的质谱无可比拟。

3.2强大的De novo 测序功能

     Q-TOF2的最强大功能是能够对蛋白质进行测序，是蛋白测序的一种新方法，是传统蛋白质N端测序，即Edman降解测序的有利补充。它的优点是样品用量少，仅fmol的样品就能够测序。另一个重要的优点是能够测N端封闭的蛋白质序列（Edman降解不能）。与Edman降解测序不同的是Q-TOF2不是对整个蛋白质进行测序，而是首先将蛋白质通过酶切（一般为胰蛋白酶），然后对其酶切肽段进行测序，因此测定的是蛋白质中任何部分的序列，不一定是N端或C端序列。ESI-MS/MS由于能测定肽段的序列，因此鉴定蛋白质的成功率很高。一般测定一个肽段的序列就可以鉴定一个蛋白质，测定2~3个肽段的序列就能十分肯定地鉴定一个蛋白质。应用Q-TOF2最多可测分子量3000Da的肽段序列。最适宜测序的肽段的分子量范围为800~2000Da。

3.3适合不稳定化合物的分子量测定和元素组成分析

     由于ESI是最软的电离技术，在一定的电压下它不会使样品分子产生碎片，因此易于得到不稳定化合物的分子离子峰，与TOF的高分辨相结合，可以测定其元素组成。

3.4适合于混合物的分析

     由于ESI是最软的电离技术，不易使样品分子裂解，因此对于小分子的样品，根据ESI谱图可确定样品的组成成份有几种，通过串联质谱则可得到其结构信息。

     由于Q-TOF2的一级质谱四极杆有选择离子的作用，因此其另一个最大优点是可以对混合蛋白质进行鉴定，对样品纯度的要求不高，不经液相分离可对6个蛋白质的混合物进行鉴定。

     由于Q-TOF2与CapLC联用，可以进行自动化DDA分析，可以进行“shot-gun”的蛋白质组学研究和多肽组学研究。

     自2001年引进以来，我们应用Q-TOF2开展了大量的工作。最主要是在蛋白质组学研究中的应用。蛋白质组学研究中鉴定蛋白质一般分两步，首先是用MALDI-TOF-MS的PMF方法进行高通量鉴定，对于MALDI-TOF-MS不能鉴定的蛋白质就需要用nanoESI-MS/MS（Q-TOF2）进行鉴定。对于一些重要蛋白质往往需要这两种方法共同确证。也就是说，nanoESI-MS/MS 是鉴定蛋白质的最强大的工具，一个蛋白质是已知蛋白还是新蛋白，是纯蛋白还是混合蛋白质一经其鉴定就可得到十分肯定的答案。

     nanoESI-MS/MS还可以对蛋白质的翻译后修饰、不同剪切形式及氨基酸序列变异进行分析。另外我们还进行了小分子和蛋白质非共价复合物的研究、中药化学组学的研究。由于我们中心是国家生物医学分析中心，对全国开放，因此该仪器为全国几十家科研单位和制药公司测试了几百份样品。主要包括蛋白质鉴定和多肽测序（如胸腺五肽、亮丙瑞林、奥曲肽、生长抑素等）以及部分药物报批用的小分子高分辨测定和元素组成分析。利用我们所测定的新蛋白的部分序列，多个单位已经克隆成功基因，表达出了新蛋白。附图为一蛋白质的鉴定结果及部分测序图，来自2D的3mI样品共测9个肽段序列，Mascot score 796，score 大于36鉴定有意义。

1．分子量测定
2．精确质量测定及元素组成分析  
3．肽质量指纹谱
4．多肽de novo测序
5．蛋白质鉴定及数据库检索
6．二硫键分析       
7．有机物串联质谱  
8．简单混合物分析
9．蛋白质突变点及修饰点分析(乙酰化、磷酸化、 糖基化 )

小分子化合物、蛋白质、多肽
小分子化合物、多肽
蛋白质
蛋白质及多肽
蛋白质
蛋白质
小分子化合物
小分子化合物、蛋白质、多肽
蛋白质

1. 973课题“以FKBP12为靶点的神经退行性疾病防治药物先导结构的发现和优化” （G1998051107）
2. 国家863高技术研究发展项目“蛋白质组技术平台的建立及其在白血病细胞泛素化通路研究中的应用”(No. 2001AA233041)等。
3. 国家863高技术研究发展项目“应用蛋白质组技术对白血病细胞凋亡相关蛋白质的高通量鉴定” (No. 2002AA232021)。
4. 北京市科技项目“四物汤的中药基因组学和化学组学基础研究” (No. H010210220113)

1. 重组人受体蛋白FKBP12与新型神经生长促进剂形成非共价键复合物的电喷雾质谱研究[2002年“中国分析测试协会科学技术奖（CAIA奖）”二等奖]
2. 应用纳升电喷雾串联等生物质谱技术对白血病细胞凋亡相关蛋白质组分析[2003年“中国分析测试协会科学技术奖（CAIA奖）”三等奖]

1. 王红霞. 张学敏. 杨松成. 肖军海. 聂爱华. 赵丽琴. 李松. 重组人受体蛋白FKBP12与新型神经生长促进剂非共价键复合物的电喷雾质谱。中国科学C辑 , 2002, 32(4):355-360.
2. Wang Hongxia, Zhang Xuemin，Yang SC, Xiao JH, Nie AH, Zhao LQ, Li S. ESI-MS study on non-covalent bond complex of rhFKBP12 and new neurogrowth promoter. Science in China, 2003, 46(3):286-292.
3. 王红霞. 靳宝锋. 王杰. 何昆. 杨松成. 沈倍奋. 张学敏. 纳升电喷雾串联质谱技术对阻断泛素通路诱导凋亡相关蛋白质的鉴定。生物化学与生物物理学报。2002, 34(5):630-634。
4. 王红霞，何昆，李卫华，魏开华，王杰，杨松成，张学敏 部分结构特殊多肽的纳升电喷雾串联质谱测序分析。军事医学科学院院刊。2003；27（1）：36-39。
5. 王红霞，李卫华，吴胜明，李爱玲，刘炳玉，杨松成，张学敏 应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点。分析测试学报。2003；22（S）：21-22
6. 王红霞. 张学敏. 杨松成. 电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF2)鉴定重组人FKBP12。药学学报。2002，37（7）：539-542。
7. 王红霞. 张学敏. 杨松成. 裴武红. 李松. 重组人FK506结合蛋白12的基体辅助激光解析电离飞行时间质谱分析. 分析化学. 2001, 29(2):125-127.
8. 王红霞. 杨松成. 蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱研究进展. 药学学报. 2001 ;36(4):315-20.
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1. 样品可为冻干粉、溶液或胶内蛋白质（必须为考染），冻干粉、溶液应无盐。样品如有毒性或腐蚀性或需特殊保存的样品，请事先声明。
2. 电喷雾质谱由于其耐盐性差，样品分析前需要脱盐，会损失部分样品，因此，在鉴定胶内酶切的样品时所需的样品量较MALDI-TOF-MS多。
3. 填写样品申请单应完整，包括样品名称、性质、数量；送样人姓名、单位、联系电话、单位地址，课题名称等所有样品申请单的各项内容。
4. 网上填写样品申请单：http://www.proteomics.com.cn/2005/userdata/user_online.asp